Раздел: --- юмор

В блог Подписаться на Дзен!

Отвечать в конференциях и заводить новые темы может любой участник, независимо от наличия регистрации на сайте 7я.ру.

Мой доклад.

Во-первых, прозаическую версию доклада я тоже выложу, иначе непонятно, что же я рифмовала. Тем более, как уже сказала Шеф, без картинок и так всё теряется (может, иллюстрации выложить в фотоальбом? Шеф говорит, гонады самцов и самок наверняка заинтригуют народ)...
Уважаемые коллеги! Позвольте представить Вам диссертационную работу «ПОЛУЧЕНИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЛЕТАЛЬНЫХ МУТАЦИЙ ГЕНА LEG-ARISTA-WING COMPLEX У DROSOPHILA MELANOGASTER»

Исследуемый нами регуляторный ген дрозофилы leg-arista-wing complex (lawc) имеет сложную молекулярно-генетическую структуру и плейотропный фенотипический эффект.

(рис.2)
Внешне его сильные мутации в основном проявляются в искривлении ног, гомеозисной трансформации аристы и преобразовании её в членистую структуру наподобие лапки, трансформированная ариста часто завершается характерным коготком.
По внутреннему краю крыла образуются характерные вырезки.
Возникают дополнительные щетинки.

(Рис. 3).
Для конкретизации функции гена крайне важно получение его мутаций с экстремальным фенотипическим проявлением. Особенно важно наличие летальных мутаций. Такие мутации позволяют во-первых проводить разнообразные Resque-тесты, то есть изучать восстановление жизнеспособности с помощью трансгенеза, а во-вторых, при помощи клонального анализа изучать материнский эффект.

31.05.2005 19:56:15,

17 комментариев

От кого: Настройки

Вы не авторизованы.

Если Вы отправите сообщение анонимно, то потеряете возможность редактировать и удалить это сообщение после отправки.

E-mail:
получать ответы на E-mail
показывать ссылки на изображения в виде картинок
Офф: мы договаривались, что вы заберете у меня горшки. Если уговор в силе, то когда и где? 01.06.2005 10:39:53, Polett
Куда и сколько чего взамен вразвес и по сколько? Я теперь вольный попугай на выпасе... 01.06.2005 19:24:11, Allllenka
natafm
Алленка, ты мне тоже вроде обещала развесить. Не передумала? Только мне надо забирать уже срочно - в среду мы уезжаем. Ребенок может подъехать куда скажешь. Напиши,а? 03.06.2005 20:12:35, natafm
Мне бы вразвес чего-нибудь, чтобы вместо ботвы растения давали цветы :-) В частности, гибискусы :-)
А то у меня сплошная зелень до потолка... По весу 1 порция на 4-5 литров воды, этого мне достаточно для 1 полива. Ну и буду очень благодарна за точное название этого чудесного удобрения и советы, где его купить :-)

Встретится смогу на следующей неделе, с понедельника по вечерам в метро, хоть в среду у Ногина, если удобно...
02.06.2005 11:22:18, Polett
мама :) 01.06.2005 10:16:02, Tatyshka
Anykey
Пошла смотреть альбом. Алллленка, поздравляю! Ты - героическая барышня!!!!!! а сколько там сопутствующих бумажек полагается... о, боже! 31.05.2005 22:27:40, Anykey
Anykey
Тю!
Пришла назад :) А где же обещанная дрозофилячья порнография?????
31.05.2005 22:28:22, Anykey
Хочешь порно? Тогда подскажи, как минимальным количеством телодвижений перевести картинки из пауэрпойнта в jpg 01.06.2005 19:22:56, Allllenka
1.Наводишь на фотку курсор,правая клавиша мыши-свойства-вкладка "общие"-приложение-кнопка изменить и из выпадающего списка выбираешь программу.
2. Если фотография открыта - Главное меню-Файл-Сохранить для Веб.
Я тоже порнухи хочу!
02.06.2005 14:59:17, Машулик
Это не фотки, это слайды в пауэрпойнт, там куча элементов на слайде, все надписи-стрелочки-графика по отдельности. 02.06.2005 17:55:18, Allllenka
(Рис. 4).
В мировой коллекции имелась всего одна летальная мутация, охарактеризованная как аллель leg-arista-wing complex, но при работе с полученной линией с помощью кроссинговера отделялись летальные мутации вне района lawc. Получить мутацию только в гене lawc не удавалось. Мы констатировали множественность летальных мутаций и не могли считать достоверными получаемые данные.
Это привело нас к необходимости заняться таким трудоемким процессом, как мутагенез.

(рис. 5)
Схема скрещиваний предполагает участие трех линий:
Первая линия со слабой lawc-мутацией, вызванной инсерцией мобильного Р-элемента (М-цитотип).
Вторая линия содержит в аутосоме источник транспозазы - элемент дельта 2-3 (Р-цитотип).
Третья линия с разрывом в Х-хромосоме в непосредственной близости от гена lawc и встраиванием по месту разрыва плеч Y-хромосомы нужна для предотвращения репарации по механизму конверсии.
Мутагенез индуцируется в половых путях самок второго поколения, при этом в хромосоме возникают разрывы. Но они не могут эффективно застроиться по механизму конверсии, так как в оппозитной хромосоме тоже есть разрыв.
В результате этих скрещиваний в третьем поколении Х-хромосома, в которой гипотетически могли возникнуть летальные мутации, была стабилизирована при помощи хромосомы-балансера. В результате индивидуальных скрещиваний самок F3 с самцами, несущими балансер по первой хромосоме, мы получаем линии дрозофил с индивидуальными нарушениями.


(рис.6) Было проанализировано 1147 линий и найдены 93 летальные мутации в Х-хромосоме, часть линий впоследствии распалась, остальные изучались при помощи дупликационного картирования.
При дупликационном картировании в геном летальных особей при помощи скрещиваний вводится дупликация изучаемого района. Если жизнеспособность восстанавливается – значит, летальная мутация находится в пределах дупликации. На фоне дупликации восстановилась жизнеспособность самцов из 33 линий. Мы можем сделать вывод о высокой эффективности примененной схемы мутагенеза (40% летальных мутаций попадают в район дупликации).
31.05.2005 19:57:20, Allllenka
(Рис. 7) ДНК полученных линий с летальными мутациями была изучена с помощью Саузерн-блот анализа
Были использованы зонды, гибридизующиеся в районе встраивания Р-элемента (зонды Est и p1.1). Исходная линия несет 2 копии Р-элемента,
Анализ гибридизующихся фрагментов показал, что
- у ряда линий наблюдается уменьшение длины инсерции
- Есть линии с делециями последовательности Р-элемента, и видимо, близлежащей последовательности (результаты гибридизации здесь не показаны)
- В ряде линий с зондом Est гибридизовались фрагменты большего молекулярного веса, чем в контрольной линии (показано на рисунке). Эти перестройки можно было объяснить инверсиями.
Три линии, содержащие инверсии, были использованы в экспериментах с дестабилизацией Р-элемента, в результате которых были получены реинверсии с восстановлением жизнеспособности. Саузерн-блот анализ этих линий показал сходство с диким типом. Вот пример гибридизации: инверсия, три дочерние реинверсии, дикий тип. Молекулярные и генетические данные подтверждают друг друга.

(рис. 8).
На этом рисунке – фенотип различных мутаций, индуцированных в процессе мутагенеза. Вот нормальная антенна и ариста. Справа – аристы особей с сильными мутациями, это производные летальных мутаций, у которых восстановилась жизнеспособность, видно, что ариста трансформирована.
Внизу крылья: слева исходная линия со слабой мутацией, типичные для lawc вырезки проявляются только за счет взаимодействия с геном cut. По центру – истинная реверсия по lawc, справа – сильная мутация.

(Рис. 9)
Вторым подходом к изучению сильного мутантного фенотипа была репрессия гена lawc при помощи химерного белка P-Ph. Ключевым элементом в модельной системе, разработанной в лаборатории Павла Георгиева, является химерный белок P-Ph, состоящий из белка Polyhomeotic с дополнительным ДНК-связывающим доменом транспозазы от Р-элемента. Polyhomeotic служит основой сборки комплекса белков Polycomb-группы, что приводит к локальной компактизации хроматина. В районе гена-мишени должен быть встроен Р-элемент. Тогда ДНК-связывающий домен транспозазы химерного белка P-Ph распознает последовательность Р-элемента, в результате чего комплекс собирается на последовательности гена-мишени и подавляет транскрипцию.
31.05.2005 19:57:31, Allllenka
(Рис. 10)
Подавление транскрипции гена lawc под влиянием химерного белка P-Ph привело к значительному усилению всех фенотипических нарушений. Верхний ряд иллюстраций относится к исходным линиям, нижний – к фенотипу компаундов. Мы видим появление дополнительных щетинок, в то время как ранее наблюдалось уменьшение их количества. Вырезки на крыле углубляются. Ариста трансформируется, что характерно только для сильных аллельных вариантов lawc. Мухам свойственна пониженная жизнеспособность, а самки еще и стерильны. Мы впервые получили настолько сильные фенотипические изменения, что были затронуты репродуктивные функции.

(Рис. 11)
В норме отдельная овариола самки состоит из гермариума и цепочки растущих фолликулов, соединенных перемычками. Из 16 клеток цисты одна дифференцируется в ооцит, остальные – в трофоциты. У мутантных особей хроматин ядер более диффузный, и сильно нарушена морфология.

(Рис. 12)
Под оболочкой из фолликулярных клеток может оказаться более одной цисты (здесь как минимум две). В растущем фолликуле крупные ядра клеток цисты вообще могут не отслеживаться. Внизу слева видна деградация цисты: ядра мелкие, разного размера, рассеяны по яйцевой камере. Справа показано отсутствие перемычек между фолликулами. Мы сделали вывод о том, что нарушения в основном связаны с соматическими клетками овариол. Также характерно отсутствие ранних форм в гермариумах 7-10 дневных самок, прослеживается параллель с фактом быстрого старения и раннего прекращения яйцекладки в линии с мутацией lawcpdel. Мы предполагаем еще и нарушение механизмов дифференцировки герминативных стволовых клеток.

(Рис. 13)
Для конкретизации функции гена важно выявить межгенные взаимодействия. Ранее были обнаружены взаимодействия lawc с генами сut, Serrate, Delta, achaete-scute комплексом и другими. Для поиска новых взаимодействий в геноме мы использовали Deficiency Kit из сток-центра в Блумингтоне – минимальный набор делеций, перекрывающий максимальную часть цитологической карты дрозофилы. Если совмещение слабой гемизиготной мутации lawcp1 и гетерозиготной делеции приводило к гибели особей, мы констатировали факт наличия взаимодействий.

(Рис. 14) Исходную зону взаимодействия сужали при помощи более мелких делеций, как видно на схеме. Красным отрезком показана исходная делеция, черными – делеции, не обнаружившими взаимодействий, между ними остается зона летальных взаимодействий. Мы обнаружили 15 летальных зон и выяснили, какие гены в них локализованы.

(Рис. 15)
Оказалось, что многие из локализованных в «летальных» зонах генов являются транскрипционными факторами или влияют на деление клеток. Мы намерены далее поставить эксперименты с мутациями по отдельным генам, чтобы выяснить, какие из них конкретно ответственны за возникающие нарушения. Помимо делеций, мы ставили эксперименты с мутациями в различных генах, кодирующих транскрипционные факторы, и обнаружили взаимодействия с целым рядом генов. Так, в компаундах lawcp1 и транскрипционного фактора e(y)1 наблюдается стерильность самцов.
Нас заинтересовали причины стерильности самок самцов lawcp1 в компаундах с e(y)1.
31.05.2005 19:57:59, Allllenka
(Рис. 16)
Теперь о причинах стерильности самцов lawcp1 e(y)1. У самцов 16 клеток цисты дифференцируются в сперматоциты первого порядка и из них в после прохождения мейоза получается, соответственно, 64 сперматозоида. Наблюдавшаяся у компаундов lawcp1 e(y)1 стерильность самцов связана с торможением сперматогенеза на стадии сперматоцита первого порядка. Хроматин клеток диффузный, мейотические формы почти отсутствуют.

(Рис. 17)
У самцов наблюдаются аномалии деления клеток. Это двойное окрашивание одних и тех же клеток, слева окрашена ДНК, справа – тубулин (маркер веретена деления). В результате аномального деления все хромосомы оказались в одной полиплоидной клетке.

(Рис. 18)
Все эти нарушения приводят к дефициту зрелых сперматозоидов. В норме формируются пачки сперматозоидов по 64 штуки в каждой, которые потом распадаются на отдельные клетки и переходят в семенные пузырьки. У стерильных самцов в семенниках есть только отдельные сперматозоиды, возможно, это следствие гибели клеток цисты.

Таким образом, данные, полученные различными методами, подтверждают участие гена lawc в регуляции транскрипции, его роль в процессах деления клеток.

(Рис. 19) Выводы разрешите не зачитывать.
Вопросы, пожалуйста.
31.05.2005 19:58:25, Allllenka
Дрозофилам наказанье
Все мутации по lawc –
Им арист в обрубки ног
Светит преобразованье.

Усечённые крыла
Аномально расставляя,
На культяшках ковыляя,
Муха кое-как ползла.

Но генетики мечтали,
Чтоб углУбить и понять,
Далее поизучать
Нуль-мутации, летали.

Это много что даёт:
Rescue есть эксперименты –
Очень важные моменты,
Лишь леталь здесь подойдёт.

С дрожжевой рекомбиназой
Перримоном тест рождён –
Вмиг гомозиготный клон
Порождается флипазой –

Тест на maternal effect
На зиготах выявляет,
Цитоплазма как влияет.
Нам хотелось знать ответ.

Из сток-центра в Блуменгтоне
Получили мы леталь,
Обрели Святой Грааль,
Генотип – как на ладони.

Но… поболее одной
Там мутаций оказалось,
Кошка нам в мешке досталась,
EMS тому виной.

Значит надо нам самим
Без надежд на заграницу
Заловить свою синицу.
Блумингтон? Да вирус с ним…

Мы, согласно нашей теме,
Провели мутагенез,
И пошёл у нас процесс
Эффективно и по схеме.

В хромосоме есть дыра,
Встроена туда другая,
Чтоб конверсия шальная
Не прошла бы «на ура».

Есть в одной аутосоме
Дельта 2-3 элемент -
Р-инсерт в любой момент
Активирует в геноме.

В нашем гене есть инсерт
(Красной стрелкой обозначен).
Он пока не озадачен,
Тих сидит, как интроверт.

Всех трёх линий компоненты
Совместим у дам F2.
Дальше дело – трын-трава,
Всё, стрижём купоны с ренты.

Получай себе леталь,
Изучай свои аллели,
Мы ль не этого хотели
И рвались не в эту ль даль?

Результат почти стократно
Ожиданья перекрыл:
Целый ящик дрозофил.
Изучайте, раз занятно.
31.05.2005 19:59:57, Allllenka
На блотах уяснено
В ДНК разнообразье.
Изменений там – как грязи
(Всё в таблицы внесено).

А к инверсиям с особым
Мы пристрастьем подойдём,
Их обратно развернём
С интересом нездоровым.

На блотах как Oregon
Реинверсии бывают,
Мухи с ними выживают
(Факт сей жизнью подтверждён).

Но и без мутаций в гене
Гены можно отключать,
Коль Р-элемент сыскать
Выйдет в локусе-мишени.

Ведь его распознаёт
P-Ph – белок химерный, -
Тот, что комплекс мультимерный
Для «отключки» создаёт.

Вот успешно сей белок
Всё, что надо отключает,
Чем всерьёз усугубляет
Фенотип мутантов с lawc.

Тут самцы одни фертильны
(Хоть недолгий век живут),
Самки ж яйца не несут,
Потому как все стерильны.

Некомпактен хроматин,
Часто цист объединенье,
В перемычках нарушенья,
Результат тому один:

Нету нам материала
Эмбрионы получать,
В rescue-тестах изучать
Их развития начало.

Вот другой этап работ
И объём немалый действий:
Скрининг тех взаимодействий,
Что в компаундах даёт

И с делецией, и с lawc’ом
Гибель иль какой дефект…
Словом, мухам всяк эффект
Выходил обычно боком.

Мы нашли 15 зон
Там, где с lawc’ом есть летали,
Гены в них переписали
(Согласитесь, есть резон).

Много среди них нашли
Что влияют на деленье
Или генов подключенье
(Всё в таблицы занесли).

Вот с enhancer(yellow)one
lawc-мутаций усиленье
(И причин наразмноженья
Сих самцов анализ дан).

Хроматин опять диффузный,
Он деленья тормозит.
В клетку иногда бежит
Хромосом весь рой союзный.

Зрелой спермы – с гулькин нос.
Всё сидит в сперматоцитах,
Их как комаров небитых,
Не идёт почти мейоз.
31.05.2005 20:00:38, Allllenka
Так и сяк мы доказали:
lawc в транскрипцию включён,
Для делений важен он.
Всё ль нам ясно? Ох, едва ли…

Но ведь в дисер запихать
Мы не все стремились факты,
Уж и так велик он как-то,
Надо и приличья знать.

В эмбрионах нарушенья
Будет Ната изучать.
Предпочту я умолчать
Про процесс нерасхожденья –

Раскрывая свой талант,
Это вам расскажет Юля.
(Описать я вам смогу ли –
Что за славный аспирант!)
31.05.2005 20:01:03, Allllenka


Материалы сайта носят информационный характер и предназначены для образовательных целей. Мнение редакции может не совпадать с мнениями авторов. Перепечатка материалов сайта запрещена. Права авторов и издателя защищены.



Рейтинг@Mail.ru
7я.ру - информационный проект по семейным вопросам: беременность и роды, воспитание детей, образование и карьера, домоводство, отдых, красота и здоровье, семейные отношения. На сайте работают тематические конференции, ведутся рейтинги детских садов и школ, ежедневно публикуются статьи и проводятся конкурсы.
18+

Если вы обнаружили на странице ошибки, неполадки, неточности, пожалуйста, сообщите нам об этом. Спасибо!